新时代下对于Western Blotting发表文章的新要求（一）

　　Western Blotting技术已经问世四十多年了，依然是蛋白分析中最常用和主流的方法。但近些年Western Blotting数据重现性，稳定性，定量准确性等问题，也使这项技术被推到了风口浪尖，同时也有很多文章因为Western Blotting数据的问题而撤稿，而为了尽可能提高Western Blottig数据的可靠性和准确性，期刊杂志对于接收涉及Western Blotting技术数据的文章也提出了新的要求。

　　接下来我们看看都要哪些要求：

　　1.不建议跑平行胶，因为平行胶和剥离膜孵育体系，操作条件的不一致，影响定量的准确性，因此最好内参和目的蛋白要在同一张印迹膜上

　　2.选择宽态范围的方法，确认信号强度与所上样量之间的线性关系，例如用胶片做化学发光方法的动态范围就很窄，不建议使用：

　　数字成像相比胶片动态范围更宽、定量更准确

　　3.强烈推荐使用总蛋白进行归一化，因为看家蛋白容易受处理条件影响而发生变化，影响定量的结果，使用总蛋白定量更真实地反映目标蛋白表达量的变化

　　4.提交原始数据，例如：JBC，PLOS和CELL等杂志都要求要提供原始数据

　　聊完了期刊杂志的一些要求，那Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统是如何帮助您获得满足期刊杂志Western Blotting要求的数据：

　　★ Sapphire是多荧光检测系统，可多达4个激光光源，同时进行4通道荧光检测，获得更快的工作流程和更可靠的定量数据

　　荧光Western Blotting使用荧光基团标记的二抗进行检测，膜上的靶标蛋白浓度与可见荧光信号强度呈线性关系，实现真实可靠的定量分析。荧光染料发射光谱不同，因此在一张印迹膜上可实现多个蛋白检测。这样目标蛋白和内参蛋白在同一张膜上，就可以避免数据造假的情况发生，更容易被期刊杂志接收。

　　图1：通过使用四种光谱不同荧光基团标记的二抗，可以同时检测多达四种不同的蛋白。HeLa细胞裂解物上样，anti-tubulin (550nm, 绿色), anti -actin (700nm红色), anti-GAPDH (800nm, 灰色),和anti-transferrin (490nm, 蓝色)这四种蛋白同时成像，没有交叉。

　　★ Sapphire配合AzureRed总蛋白荧光染色剂可以做总蛋白归一化和定量三个靶标蛋白，生成可以信赖的定量Western Blotting数据

　　使用总蛋白归一化，以校正泳道和样品之间的差异。传统的方法无法准确知道条带灰度值和强度的变化是由于样品的生物学变化引起的，还是由于上样或样品的不一致性或样品制备的差异引起的。总蛋白归一化优势如下：

　　☑ 总蛋白比看家基因等内参的线性检测范围更宽。

　　☑ 在整个实验和系统中更加稳定。

　　☑ 能有效排除实验条件和体系对结果的影响。

　　☑ 更真实地反映目标蛋白表达量的变化。

　　图2.总蛋白归一化和定量三个靶标蛋白. Tubulin 红色通道, Actin 蓝色通道,GAPDH绿色通道, AzureRed/total protein 用灰色表示

　　图3.使用总蛋白对Tubulin信号进行归一化，纠正上样误差

　　★ Sapphire配有独特的三种检测器设计，最大限度地提高仪器的检测动态范围，保证结果的准确性

　　PMT检测器用于蓝光检测和磷屏成像。

　　APD检测器用于NIR，红色和绿色荧光的检测。

　　CCD检测器用于高灵敏化学发光的检测。

　　（*ZL技术）

　　★ Sapphire提供原始数据16bit的tiff图给到期刊，这里的tiff原始数据是指未经裁剪，像素修改，对比度调整等任何操作的图，保证结果的真实性和可靠性

　　Sapphire除了进行荧光印迹膜，化学发光印迹膜检测外，还可以进行In cell western孔板成像、In-Gel胶，2D和2D DIGE、切片扫描、组织成像和动植物成像、同位素标记样品磷屏成像等。