ELISA临床质量评价与质量管理（一）

ELISA试剂的评价（evaluation）分两个方面：一是试剂本身的质量评价，符合一定要求后才能生产供应；一是在临床应 用中效果的评价。以肝炎ELISA诊断试剂为例，首先必须通过中国药品生物制品检定，以得到生产的许可。检定内容除包装、标签、 说明书等外，对试剂的性能，如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定，通过对一系列参比品的检测，结果符合要求者才为合格 。ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测，以观察其实际应用价值。部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这 方面进行了工作，通过质量评价，促进了试剂质量的提高。

6.1　诊断试剂临床质量评价要点

从临床应用角度考核检验试剂的可靠性，是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的。目前还很难找到 100%可靠的试验，任何试验都会出现假阳性或假阴性。判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准。临床应用的灵敏度用 疾病患者试验阳性的百分率表示，特异性以无病者试验阴性的百分率表示。

进行这种评价，首先需要收集有关的病人血清，然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定，以确定其为阳性或阴性。

这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"（panel）。被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表：

表中a为真阳性，b为假阳性，c为假阴性，d为真阴性。
被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算：
灵敏度(%)=a/(a+c)×100%
特异性(%)=b/(b+d)×100%
符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%
一般认为灵敏度或特异性>90%为良好。符合率是综合灵敏度和特异性的指标。

6.2　临床考核血清盘的制备要求

1、采用人的原血清；
2、 血清盘应具有相应的稳定性；
3、 血清盘中样本不含防腐剂，或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂；
4、 血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半；
5、 阳性样本中，应有一定数量的强阳性和弱阳性样本；
6、 血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品，以检验试剂的灵敏度。
7、 血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质（RF因子）的样本，
　　以检验试剂的特异性。

6.3　临床考核血清盘的建议

以抗 -HBc-IgM为例，部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本，经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选。 选出血清70份，其中阳性29份，阴性41份，组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘。在70份样本中，除7份为无病历的质控血 清外，抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例；抗-HBc-IgM 阴性的40份样本中，含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例（均为恢复期采的血样）、慢性活动性肝炎8例（其中5例为恢复 血样）。

因此，这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核，可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开，具有临床诊断意义。

质量管理

ELISA是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及 既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、 肿瘤学和细胞因子等领域。ELISA的影响因素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。

分析前质控
●人员培训   实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：
◎检验项目的基本原理 （ELISA原理）；
◎临床意义；
◎熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；
◎熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）；
◎ 熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。
◎某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。
分析前质控
◎ELISA原理：1971年Engvall等人把免疫组化的EIA技术应用于临床检验发展为ELISA技术。
特点 ：在固相表面组装免疫活性物质形成"免疫吸附剂"
                 酶标记免疫活性物质，进行信号放大；
                 有二步温育反应二次洗涤过程；
                 灵敏度特异性相对较高。
局限性：只能检测到ng水平
                      精密度差（批内CV15-20%）；
                      线性范围窄（一个数量级）；
                      存在"HD-HOOK"效应。

ELISA原理
●根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法。
●双抗体（原）夹心法  检测抗原（体）的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载 体和酶标抗体检测溶液中的抗原（适用于二价以上抗原,不能测小分子半抗原）。
●间接法  检测抗体的方法，利用酶标记的抗抗体（第二抗体）检测已与固相抗原结合的抗体。
●竞争法  检测抗原或小分子半抗原、抗体，以测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果 如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。

ELISA原理
今后的发展方向
●聚苯乙烯表面的高级制备。已有的技术是酰肼化（聚二氟乙叉，PVDF）；生物素化；预包被多聚赖氨酸等，均是ZL产品。
●酶促信号放大的改变，如酶促荧光、酶促化学发光等。

ELISA临床意义
●各型肝炎的特征及标志物
乙肝二对半的模式及临床意义
HBsAg  HBeAg  HBcAb-IgG   HBcAg-IgM   HBeAb    HBsAb    &n bsp;    临床意义
+　　　　+　　　　- 　　　　 -　　　　-　　　　-　　　　急性HBV感染早期HBV复制活跃
+　　　　+　　　　+　　　　　+　　　　-　　　　-　　　　急慢性HBV感染，HBV复制活跃
+　　　　-　　　　+　　　　　+　　　　-　　　　-　　　　急慢性HBV感染，HBV复制中跃
+　　　　-　　　　+　　　　　+　　　　+　　　　-　　　　急慢性HBV感染，HBV复制低跃

+　　　　-　　　　+　　　　　-　　　　+　　　　-　　　　HBV复制停止或极低
-　　　　-　　　　+　　　　　+　　　　-　　　　-　　　　平静的HBV携带状态，HbsAg

-　　　　-　　　　+　　　　　-　　　　-　　　　-　　　　HBV既往感染，未产生抗-HBs
-　　　　-　　　　+　　　　　+　　　　+　　　　-　　　　抗HBs出现前期，HBV复制低
-　　　　-　　　　+　　　　  -　　　　+　　　　+　　　　HBV感染恢复期
-　　　　-　　　　+　　　　  -　　　　-　　　　+　　　　HBV感染恢复期
+　　　　+　　　　+　　　　　+　　　　-　　　　+　　　　不同亚型ＨＢＶ再感染
+　　　　-　　　　-　　  　　-　　　　-　　　　-　　　　ＨＢＶ－ＤＮＡ整合
-　　　　-　　　　-　  　　　-　　　　-　　　　＋　　　病后或接种疫苗后获得免疫　

试剂盒选择

◎卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产 品，试剂应从灵敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性，安全性及经济性作出全面的评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力（假阴性越少越好） ，取决于包被物的全面性。
◎特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力（无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗原（体）的纯度及特异性。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围
试剂盒选择
◎稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采用破坏性试验即将试剂存放于37℃保存，定期测定其灵敏度，特异性和精密度等指 标，直到其质量指标开始下降为止，通常认为37℃每稳定一天相当于4-10℃保存一个半月。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断简单明了，）定量试验结果计算也 应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。