IAC 作用的基础是色谱法与抗原抗体的可逆反应平衡相结合的理论,遵循经典的 Scatchard方程。因此,影响 IAC 效率的因素有很多。
①柱容量:免疫亲和柱常用的柱床体积为1mL。其高效特异性保留能力,使之能在较小的柱容量或柱床体积下完成净化过程,减少了非特异性吸附并节省了昂贵的柱材和抗体。另外,柱容量与抗体的偶联量有很大关系,但并非无限制成正比。因为活化的凝胶中与抗体蛋白结合的活化基团数量是有限的,与活化基团结合达到饱和时,理论柱容量达到最大。此外,亲和柱偶联的抗体浓度过高,抗体之间产生相互作用,将影响抗体与抗原的结合,降低柱容量。
②基质的选择:针对各种类型的药物分子,可以选择不同的基质,以便有效提高净化效率。适宜的基质对于活化剂的选择、抗体的偶联、抗原抗体相互作用及无关杂质的去除,都有着举足轻重的作用。作为亲和柱的载体,最好是均一的珠状颗粒。溴化氰活化的琼脂糖(sepharose)是最经典的亲和柱的柱材。其他基质应用也很多,如 Kaster 等对纤维素作为 IAC 基质的颗粒大小、柱的耐受力、动力学容量等都进行了很好的描述。
③基质的活化与抗体的偶联:活化与偶联反应条件要求温和、简单,尽可能降低对抗体的活性和基质结构的破坏。基质活化通常在骨架上引入强亲电基团,然后与抗体上的亲核基团如—NH2、—OH、—SH 等发生取代反应,使抗体连接于基质上(偶联)。虽然抗体的化学特性直至20世纪中叶才被揭示,利用抗体进行分析却已有百年的历史。抗血清中的抗体含量最多的是 IgG,所以常用其制备免疫吸附剂。已有人研究多样性的抗原结合片段对增加识别位点浓度的各种优点,但实验室还没有广泛的应用,如 Fab 片段很容易从单抗或多抗中获得,这种片段已被用作在线偶联毛细管电泳的免疫吸附剂。IAC 技术应用的抗体有两种类型,即单克隆抗体(McAbs)和多克隆抗体(PcAbs)。与单抗相比,多抗的抗原决定基的特异性和结合特性是多样的,因此制备时使用纯抗原,以防止产生不必要的抗体。但是多抗包含了所有的抗体亚类,对变性条件的抵抗力也高于单抗,因此多抗制备的IAC 柱寿命较长。抗体偶联分为随机偶联和定向偶联两种,随机偶联的抗体以其不同部位随机偶联到同相载体上,将导致抗体与抗原结合的活性位点变少,损失结合力,完全随机偶联会损失66%的结合力。定向偶联的抗体偶联到基质后抗原结合位点指向流动相,抗体偶联部位应为 Fc 片段、末端蛋白或通过连接分子偶联。可以应用来自葡萄球菌细胞壁的PrA 与 PrG 结合抗体分子的 Fc 部位,也可用胃蛋白酶水解抗体,产生 Fab 或单链抗体(Fv),其 C 端巯基定向固定于基质。
④抗原抗体结合能力:Preiffer 等在评价应用单克隆抗体的 IAC 中影响抗原结合能力的因素时提到,因为抗体与琼脂糖基质的结合是多价结合,所以影响了与抗原的结合能力,因此在选择偶联条件时,一定要使抗原结合能力最大化;激活剂的浓度也影响抗原结合,在使用 CNBr 激活基质时,为了使抗体偶联后有较大的抗原结合能力,要尝试不同浓度的CNBr,且过高浓度的溴化氰活化的琼脂糖会使抗体蛋白偶联在胶珠外部,而不能渗透到里面,从而影响了抗原结合能力。合适的 pH 值能减少抗体的多点结合而提高抗原结合能力。抗原抗体相互作用的基础是分子互补的空间化学结构,并在抗原抗体间形成一系列复杂的范德华力、库仑力、疏水作用、氢键及立体构象互补。由于抗原抗体结合强度很大,从免疫亲和柱上洗脱抗原是此项技术中的关键步骤。洗脱抗原时,柱的环境必须改变,使Ka 值下降。
⑤流动速率与柱压:流动速率应与抗原抗体反应速率相匹配,流动速率高则结合反应效率低,一般的流速在0.4～4.0mL/min。不同的反应体系要确定各自的最佳流速。免疫亲和柱的柱压一般低于正常柱压,过高的压力(>3.4×106Pa)会对柱产生剪切力,破坏抗原抗体的结合,降低柱的效率,还有可能将柱料作为杂质混到分析物中。一般来说,为了防止抗体脱落,压力最大值应为0.34×106Pa。
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