亲和色谱法条件的选择

亲和色谱法一般采用柱层析法,要达到好的分离效果,必需选择好操作条件。

①吸附  亲和柱所用的平衡缓冲液的组成、pH值和离子强度都应选择最有利于配基与生物大分子形成复合物。吸附时,一般在中性条件下,上柱样品液应和亲和柱平衡缓冲液一样,上柱前样品应对平衡缓冲液进行充分透析,这有利于络合物的形成。亲和吸附常在4℃下进行,以防止生物大分子因受热变性而失活。上柱流速尽可能缓慢,流速控制在1.5mL/min。流出液需及时检测,以判断亲和吸附效率。

②洗涤  样品上柱后,用大量平衡缓冲液连续洗去无亲和力的杂蛋白,层析色谱上出现第一个蛋白峰和其他杂质峰。除了用平衡缓冲液,经常还用各种不同的缓冲液或有机溶剂洗涤,这样可以进一步除去非专一性吸附的杂质,在柱上只保留下专一性的亲和物。

③洗脱  洗脱所选取的条件应该能减弱亲和对象与吸附剂之间的相互作用,使复合物完全解离。由于亲和层析中亲和对象差异很大,洗脱剂很难统一标准。如果亲和双方吸附能力很强,大量的洗脱液往往只能获得平坦的亲和物洗脱峰。此时往往要改变洗脱缓冲液的 pH 值和离子强度,但这种改变不能使亲和物失去活性,大多数用0.1mol/L 乙酸或0.01mol/L 盐酸,有时也可用pH值为10左右的0.1mol/L NaOH溶液洗脱。

④再生  当洗脱结束后,需要用大量洗脱剂彻底洗涤亲和柱,然后再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡,亲和柱上可以再次加入试样,反复进行亲和层析。暂不用的亲和柱可存放在防菌污染的冰箱或冷室(低于4℃)中,以备下次再用。