互补DNA的合成方法

（1）取第一链反应液20uL，再依次加入：

10X第二链缓冲液20uL

DNA聚合酶123ul。

RNaseH0.8ul

H2O加至终体积为100/uL

（2）轻轻混匀，如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定，可取出10uL至另一eppendorf管，加入2～5uLCi[α一32P]dCTP。

（3）14℃温浴2h（如需合成长于3kb的cDNA，则需延长至3～4h）。

（4）掺入测定eppendorf管中加入90ul 50mM EDTA，取10ul进行同位素掺入放射性测定．余下的可进行电泳分析。

（5）将cDNA第二链合成的反应液70℃处理10min，低速离心后置于冰上。

（6）加入2uL T4 DNA聚合酶，37℃温育10min。

（7）加入10uL 200mmol/L EDTA终止反应。

（8）用等体积苯酚：氯仿抽提cDNA反应液，离心2min。

（9）水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍体积的7.5mol/L醋酸铵（或0.1倍体积的1.5mol/L醋酸钠，pH5.2），混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇（-20℃），-20℃放置30min后离心5min。

（10）小心丢去上清液，加入0.5mL冰冷的70%乙醇，离心2min。

（11）小心移去上清液，干燥沉淀。

（12）沉淀溶于10～20ul TE缓冲液。