实验步骤 |
一材料与设备
1)poly(A)+RNA,lmg/ml
Z)oligo(dT)12-18,lmg/ml
3)lmol/LTris-Cl(pH7.6)。
4)1mol/LTris-Cl(pH8.3)
5)lmol/LKC1
6)25 mmol/LMgCl2
7)dNTP 混合物,各 5 mmol/L
8)0.lmol/LDTT
9)RNasin。
10) 反转录酶,鼠源反转酶 (Pharmacia 公司,200U/ul) 或禽源反转录酶(20U/ul)
二、操作方法
(一) 使用鼠源反转录酶合成 cDNA
1) 在灭菌微量离心管中混合下列物质,并置于冰上:
Poly(A)+4RNA,lmg/ml 10ul
oligo(dT)12-18,lmg/ml 10ul
lmol/LTris-Cl(pH7.6) 2.5ul
lmol/LKC1 3.5ul
250 mmol/LMgCl2 2ul
dNTP 混合物,各 5 mmol/L 10ul
0.lmol/LDTT 2ul
RNasin 25U
鼠源反转录酶 200U
加水至总体积为 50ul
2) 于 37°C 反应 lh
3) 纯化回收. 保存于一 20℃
(二)使用禽源反转录酶合成 cDNA
1) 在火菌微量离心管中混合下列物质,井置于冰上:
poly(A)+RNA,lmg/ml 10ul
oligo(dT)12-18,lmg/ml 10u1
lmol/LTris-Cl(pH8.3) 2.5uI
lmol/LKC1 3.5ul
250 mmol/LMgCI2 2ul
dNTP 混合物,各 3 mmol/L 10ul
0.lmol/LDTT 2ul
RNasin 25U
禽源反转斌酶 40U
加水至总体积为 50ul
2) 于 42℃ 反应 lh
3) 纯化冋收,保存于一 20℃
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