BDA皮质脊髓束神经顺行示踪在大鼠脊髓损伤模型中的应用

1.麻醉后将头部同定于动物实验用立体定向架卜，切开有额顶头皮，用微型钻磨去颅骨形成5ram直径大小网形骨窗

2.在手术显微镜下剪开硬脑膜，用微量注射器将10％BDA溶液(美国Molecular Probes公司产品)缓慢注入右侧的感觉运动区皮质(sensorimotor cortex)内。注射时将微量注射器同定在一 体定向支架上，选择无血管区作为注射点，每个注射点分别在距皮层表面0．5、1．0和2．0mm处各注药一次，每次剂量0.5微升 。每次注射后针头滞留10min， 然后缓慢进退针。每个动物接受10个皮层注射点，BDA注射总量为2100微升。

3.注射完毕后用薄层明胶海绵覆盖脑表面，缝合头皮。

4.2周后再次麻醉动物，打开胸腔，用4 生理盐水和4％多聚甲醛液行心脏灌注后，取出大脑和脊髓组织，置于4％多聚甲醛液中4~C保存，待处理。
   

        BDA染色显影：

1.分别取大脑和各段脊髓组织，脊髓分别取上颈段(C )，胸段(Ts嘏)，腰段(L． )，
用冰冻切片机连续切片，组织切片厚度为40 m。

2.采用自由漂乳法将组织切片先后在以下溶液中孵化：
含0．1％H2O2的甲醇溶液10min、含0．5％Triton x—IOOPBS溶液(PBS—T)30min，抗生物素蛋白一生物素一
过氧化物酶复合液(avi(1inIbi0tin—per0xidase，美国Vector Laboratories公司产品)lh；用PBS-T液冲洗组织切片两次，每次各10min，最后在二氨基联苯胺(Vector laboratories公司产品)中显影5rain。

3.上玻片、风干、脱水及盖玻片覆盖。