用CaCl2处理制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

1 从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml培养瓶中。

于37℃振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。

2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，冰上放置10～20min；

3 于4℃4000转 /分离心10min，回收细菌细胞；

4 将管倒置1min，以使最后残留的痕量培养液流尽；

5 以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000转 /分离心10min，回收细菌细胞；

6 每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。

7 用无菌吸头从感受态细胞悬液中取200μl转移到无菌的微量离心管中，加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻旋以混匀内容物，冰浴30min；

8 将离心管放到预加温到42℃的水浴中，90s；

9 将混合物快速转移到冰浴中，冷却1-2分钟，加入适当的培养基在37 ℃培养45 分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因；

10 将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的平板培养基上。

11 将平板置于室温至液体被吸收 ，倒置平板于37℃培养箱中，12～16h，平板培养，克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。