血清HBV－DNA模板二种提取方法比较

摘 要 目 的 ： 选 择 提 取 血 清 HBV－ DNA模 板 的 最 佳 实 验 。 方 法 ： 用 碱 裂 解 法 、 直 接 煮 沸 法 二 种 方 法 提 取 血 清 HBV－ DNA模 板 然 后 进 行 对 比 分 析 。 结 果 ： 直 接 煮 沸 法 优 于 碱 裂 解 法 ， 具 有 方 法 简 单 易 行 且 阳 性 率 高 于 碱 裂 解 法 ， 二 种 方 法 结 果 经 u检 验 后 ， 具 有 显 著 性 差 异 P<0 01。 结 论 ： 直 接 煮 沸 法 提 取 血 清 HBV－ DNA模 板 优 于 碱 裂 解 法 ， 是 值 得 推 荐 的 一 种 经 济 、 简 单 、 易 行 实 验 方 法 。 



　　关 键 词 ： 乙 肝 病 毒 (HBV)； 脱 氧 核 糖 核 酸 (DNA)； 直 接 煮 沸 法 ； 碱 裂 解 法 ； 血 清 ； 



　　对 血 清 HBV－ DNA模 板 的 提 取 ， 目 前 常 用 的 方 法 是 碱 裂 解 法 (试 剂 盒 中 带 有 的 DNA提 取 液 )。 我 们 用 同 一 份 标 本 同 时 采 用 碱 裂 解 法 、 直 接 煮 沸 二 种 方 法 提 取 血 清 HBV－ DNA模 板 。 共 做 81份 临 床 血 清 标 本 。 仪 器 为 美 国 PE公 司 5700型 荧 光 定 量 PCR仪 。 试 剂 盒 有 中 山 医 科 大 学 达 安 基 因 诊 断 中 心 提 供 。 在 完 全 相 同 的 条 件 下 进 行 定 量 测 试 然 后 做 对 比 分 析 ， 结 果 显 示 ： 直 接 煮 沸 法 优 于 碱 裂 解 法 ， 并 有 省 时 、 省 试 剂 、 省 TiP尖 、 操 作 简 便 、 易 等 优 点 ， 且 能 够 获 得 良 好 的 检 测 结 果 ， 阳 性 率 亦 高 于 碱 裂 解 法 ， 是 值 得 推 广 的 一 种 提 取 血 清 HBV－ DNA模 板 的 极 好 方 法 



1 材 料 与 方 法 ： 



1 1 1 碱 裂 解 法 ： 取 无 菌 血 清 50ul和 50ul DNA提 取 液 (0 1mol/LNaoH.2mol/LnaCI.0 5％ SDS) 于 1 5ml Eppendorf管 中 充 分 混 匀 ， 煮 沸 10分 钟 后 取 出 放 置 4℃ 10小 时 ， 10000r/min离 心 5min取 上 清 液 2ul于 反 应 管 内 ， 10000r/min舜 时 离 心 ， 上 机 扩 增 并 定 量 检 测 ， HBV－ DNA拷 贝 数 。 



1 1 2 直 接 煮 沸 法 ： 直 接 取 50ul无 菌 血 清 1 5ml Eppendorf管 中 煮 沸 10分 钟 后 取 出 放 置 4℃ 10小 时 10000r/min， 离 心 5min， 取 上 清 液 2ul于 反 应 管 内 ， 10000r/min瞬 时 离 心 ， 上 机 扩 增 并 定 量 检 测 HBV－ DNA拷 贝 数 。 



1 2 荧 光 定 量 PCR仪 检 测 ： 将 上 述 二 种 方 法 提 取 的 HBV－ DNA模 板 ， 在 完 全 相 同 的 条 件 下 (93℃ 2min 93℃ 45S 55℃ 2min)共 40循 环 )， 用 PE－ 5700型 荧 光 定 量 PCR仪 分 别 进 行 定 量 检 测 并 做 对 比 分 析 。



2 结 果 和 讨 论 



　　二 种 方 法 所 获 HBV－ DNA平 均 拷 贝 数 ， 直 接 煮 沸 法 为 4 48× 107拷 贝 ／ ml血 清 ， 阳 性 率 为 38 27％ (31／ 81)， 测 定 范 围 4 21× 103～ 1 52× 109。 碱 裂 解 法 为 4 1× 108拷 贝 ／ mL血 清 ， 阳 性 率 为 27 16％ (22／ 81)， 测 定 范 围 1 05× 105～ 1 84× 109。 经 U检 验 二 者 比 较 具 有 很 好 的 显 著 性 (U=2 61 P<0 01)。 



　　碱 裂 解 法 裂 解 液 中 含 有 不 溶 性 的 SDS颗 粒 ， 加 样 时 须 特 别 注 意 充 分 混 匀 ， TiP尖 太 细 时 会 影 响 试 剂 的 加 入 ， 并 且 此 颗 粒 极 易 下 沉 给 操 作 者 带 来 不 便 ， 稍 有 不 慎 将 会 造 成 DNA模 板 提 取 不 充 分 使 结 果 不 准 确 。 而 直 接 沸 法 不 存 在 以 上 问 题 ， 大 大 简 化 了 操 作 程 序 ， 提 高 了 工 作 效 率 ， 避 免 了 操 作 可 能 带 来 的 误 差 ， 同 时 也 提 高 了 HBV－ DNA检 测 的 阳 性 率 (11％ )。 



　　碱 裂 解 法 对 实 验 室 来 说 可 能 只 有 10％ 左 右 误 差 ， 但 对 具 体 患 者 来 讲 却 是 100％ 的 错 误 ， 况 且 10％ 的 误 差 已 经 不 低 。 因 此 笔 者 认 为 血 清 ， HBV－ DNA模 板 的 提 取 直 接 煮 沸 法 优 于 碱 裂 解 法 ， 是 值 得 实 验 室 推 广 应 用 既 经 济 又 简 单 易 行 的 方 法 ， 不 失 为 一 种 行 之 有 效 的 操 作 方 法。