（3）NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml） 20.5μl
IFN-γ（25ng/μl） 25 μl
DMEM UP TO 100 ml
过滤消毒，4℃保存
（4）低血清DMEM培养基（上室）
（5）20%FBS-DMEM培养基（下室）
2、准备
（1）溶胶，4℃过夜（Thaw Matrigel at 4℃ overnight.）
（2）室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C预冷。（Matrigel tends to form gel
very quickly at room temerature, therefore, pipets and tips using in
steps 2 and 3 have to be chilled at prior to experiements.）
3、包被基底膜（冰上操作）
（1）用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶（10mg/ml to 5 mg/ml)） （Dilute Matrigel
(10mg/ml to 5 mg/ml) in serum free-cold cell culture media (RPMI1640,
EMEM, DMEM, etc).）
（2）取100ul稀释胶加到24-well transwell上室中 （Put 100 ul of the diluted matrigel into upper chamber of 24-well transwell）
（3）37℃孵育transwell至少4-5h （Incubate the transwell at 37C at least 4 to 5 h for gelling.）
4、水化基底膜
用无血清培养基轻洗凝胶 （Gently wash gelled matrigel with warmed serum free-culture media.）
5、准备细胞悬液和小室
（1）消化法从细胞培养瓶中获取细胞； （Harvest cells from tissue culture flasks by Trypsin/EDTA；）
（2）用培养基洗3遍（Wash the cells 3 times with culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM etc) containing 1 % FBS.）
（3）重悬细胞，5×105 cells/ml，1% FBS （Resuspend the cells in media containing 1% FBS at a density of 5×105 cells/ml.）
（4）上室加200 ul细胞悬液 （Put 200 ul of the cell suspension onto the matrigel.）
（5）下室中加入600 ul细胞培养基，含有5 ug/ml fibronectin作为黏连亚族 （lower chamber of the
transwell is filled with 600 ul of culture media containing, as an
adhesive subtrate.）
6、孵育，37℃，20 to 24 h （Incubate at 37C for 20 to 24 h.
7、染色和计数
（1）棉签擦去上室上面的非侵袭细胞（Scrape off noninvaded cells on the top of the transwell with a cotton swab）
（2）移去transwells，倒置，风干（Remove transwells from 24-well plates and stained with Diff-Quick solution.）
（3）24孔板中加入500µl含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 30min后取出，PBS清洗。
（4）直径上取4个视野，照相，计数。
（5）24孔板中加入500µl 33%醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测OD值，间接反应细胞数。
小技巧：照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察、照相。经济、实用、方便。
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