平端连接法
TA克隆法
实验方法原理 |
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头;PCR产物纯化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用该酶所具有的3'→5'外切酶活性和5'→3'的聚合酶活性)。 |
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实验材料 | 模板DNA |
试剂、试剂盒 | SauI Klenow片段 T4连接酶 |
仪器、耗材 | 移液器 移液器吸头 PCR小管 DNA扩增仪 电泳槽 电泳仪 台式高速离心机 |
实验步骤 |
一、PCR反应
1. 依次混匀下列试剂
(1)H2O:35 ul
(2)10×PCR反应缓冲液:5 ul
(3)25 mmol/L MgCl2:4 ul
(4) 4种dNTP:4 ul
(5)上游引物(引物1):0.5 ul
(6)下游引物(引物2):0.5ul (7)模板DNA(约1 ng):0.5 ul
(8)混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5 ul 约2.5 U),混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3. 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10 ul 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆,可直接使用,如用平未端或粘性未端连接,往往需要将产物纯化。
1. 酚/氯仿法
(1)取反应产物加100 ul TE。
(2)加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。
(3)再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。
(4)在水相中加300 ul 95%乙醇,置-20℃下30 min沉淀。
(5)在小离心机上10000 rpm离心10 min,吸净上清液。加入1 ml 70%乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中,待用。
2. Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA,提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化,试剂包括:50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
(1)吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
(2)加100 ml直接提取缓冲液,涡旋混匀。
(3)加1 ml PCR DNA纯化树脂,1分钟内涡旋混合3次。
(4)取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
(5)将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2 ml 80%异丙醇,对微型柱进行清洗。
(6)取出微型柱置于eppendorf管中,12 000 g离心20秒,以除去微型柱中的洗液。
(7)将微型柱放在一个新eppendorf管中,加50 ul TE或水,静止1分钟后,12 000 g离心20秒。
(8)丢弃微型柱,eppendorf管中的溶液即为纯化DNA,存放于4℃或-20℃。
四、载体加dT尾
1. 将1 ug pUC19用SmaⅠ全酶切。
2. 在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4 ul 4种dNTP改为4 ul 25 mM dTTP。
3. 加入1 ul(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
4. 按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
5. 加入2倍体积 95%乙醇,在-20℃下沉淀1 h。
6、离心,用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1. 在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。
2. 加1 ml T4DNA连接酶,1 ml 10×连接缓中液,混匀,16℃连接过夜。
3. 取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1. 在50 ml的PCR产物中,直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
2. 37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。
3. 用酚:氯仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于7 ml ddH2O中。
5. 质粒用Smal 切开后,70℃ 15分钟灭活酶,取1 ml (约0.1 mg)加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ,连接缓冲液1 ml 。
6. 取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
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注意事项 |
1. PCR反应液可直接用于连接,但最好对PCR产物纯化后进行连接,既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。 2. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
4. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
5. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
6. 纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7. PCR产物中矿物油应尽量吸去,否则会影响提取DNA的 产量。
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其他 |
一、 PCR反应中的主要成份 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则: |