探针的非放射性标记技术-2

一；仪器：同上

二：试剂：ECL标记盒，其余同上

三：操作：1：将待标记的DNA稀释至10ng/ml

2：将上述DNA在100℃5分钟，冰浴5分钟

3：离心后加入10ulECL标记混合物，混合均匀

4：加10ul戊二醛溶液混匀，37℃20分钟，此反应液可直接用于杂交也可在50％甘油中－20℃保存。

4：PCR扩增制备带标记探针

用标记脱氧单核苷酸部分代替PCR反应体系中的脱氧核苷酸（一般是带标记的dUTP代替dTTP），经PCR扩增后标记基团随机搀入扩增产物－DNA探针中。这样使探针浓度高，可检测标记基团量多，灵敏度高，与缺口平移法制备探针相比，具有方便简捷的特点，并且由于具高灵敏度因此在检测低丰度，低拷贝数的目的片断时，尤其有效。一般可用来进行搀入的带标记基团可以为同位素标记基团、臭化脱氧尿苷标记基团、也可为其他非放标记基团如生物素、地高辛等。下面以生物素和地高辛为例介绍探针的PCR标记技术。

一：生物素标记

应用bio-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

操作1：配制反应体系

dNTP的组成dATP、dCTP、dGTP各20mmol,dTTP 15mmol, bio-11-dUTP 5mmol混匀，其他试剂如常规PCR。

2：25循环后，冻存，取出化冻，趁下层水相尚在冰冻状态，吸尽石蜡油

3：水相中20mg/ml糖原1ul, pH5.2 2.5MnaAC10ul,220ul无水乙醇。混匀后－20℃过夜

4：离心取沉淀，冷冻干燥后100ul水或TE复溶。

二：地高辛标记

应用dig-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

操作1：配制反应体系

dNTP的组成dATP、dCTP、dGTP各200umol,dTTP 130umol, bio-11-dUTP 70umol混匀，其他试剂如常规PCR。

2：35循环扩增产物

3：扩增产物纯化与DIG随机标记探针方法相同（仅沉淀时，50ulPCR反应液中加入5ul4MliCl和150ul冰乙醇）。

注：1：标记时标记基团在dNTP中占的比例不能太高，因标记基团与dTTP相比具位阻效应，比例太高PCR扩增及以后的杂交都要受到影响。

2：靶DNA用量不能太高，生物素标记中控制在0.2fmol左右；地高辛标记中可低至0.1ng。