1、全身用药治疗绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、各类急性白血病、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、消化道癌、宫颈癌及恶性淋巴瘤等。
2、动脉插管灌注对头颈部癌和肝癌有较好疗效。
3、大剂量甲氨蝶呤辅以甲酰四氢叶酸钙救援（HDMTX-CFR疗法），作为骨肉瘤、软组织肉瘤、恶性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌等术后辅助化疗或晚期病变全身治疗有一定疗效。
4、甲氨蝶呤于1988年开始用于治疗类风湿关节炎（RA）。而甲氨蝶呤与阿达木单抗等生物制剂联合用药，可以更有效地缓解RA患者的疾病症状，减缓关节损伤的进展（X线显示），并且可以改善身体功能。与传统药物相比，阿达木单抗等生物制剂的疗效强且持久，且耐受性良好。
5、还可在异位妊娠局部胎囊注射缓解出血。
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