三、免疫组化实验中的抗原修复
1．酶消化：如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶
2．抗原热修复：高压法、微波法、水煮法
众所周知，免疫组化染色中最关键的莫过于抗原修复，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，热抗原修复优于酶消化，更有效，染色结果更易一致，操作单一。
3．修复时间：既要获得最强的染色结果，又要保持组织形态的完整性。许多抗原修复存在的问题是组织固定时间过短时，强烈的抗原修复可引起形态破坏、脱片及组织完全消化，解决的方法可采用较短时间的热修复或减少酶的消化时间。
4．抗原修复缓冲液：有柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）、 Tris (pH7-8)、EDTA(pH8.0～9.0) 、 EGTA(pH9.0) 等，柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体，Tris和 EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。目前还没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和EGTA缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择高pH值的修复液。例如：ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。
5．抗原热修复注意事项：无论哪一步都不要让切片干凅，加热后需要冷却15－30分钟。充分的抗原修复是影响染色结果的唯一重要因素，加热的温度和时间可导致修复不足或过度修复。
6．抗原热修复对组织中内源性生物素的影响：抗原热修复在增强抗原决定簇表达的同时，也增强了组织中内源性生物素的反应。采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）检测系统，组织中内源性生物素容易出现人为假象，在加热抗原处理条件完全相同的阴性对照片中可以观察到较强的内源性生物素的反应，没有经过热抗原处理的切片中没有出现类似的情况。在细胞浆中呈均一的细颗粒状的浅棕色阳性，有时表达也非常强，与真阳性的结果表达很相似，在以往的免疫组化染色中内源性生物素的影响对诊断造成许多的误差，却常常被忽略。值得提醒的是在概念上一定要十分清楚，阴性对照片必须与一抗的抗原修复处理条件完全相同，才能准确发现内源性生物素出现的部位。
7．内源性生物素封闭方法：一般在抗原修复以后，加抗体前使用卵白素进行生物素阻断处理，也可使用非生物素的检测系统，如：EliVision、EnVision、SuperVesion等。
四、免疫组化染色实验操作规范
1．脱蜡：二甲苯 ――→ 酒精 ――→ 蒸馏水
3．血清封闭：在加入一抗前需用二抗的正常血清进行封闭，可以减少非特异性结合。目前使用的二步法检测系统可以免去这一步骤。
4．抗体使用：已有大量的即用型抗体供实验室使用，厂家已进行过多次的实验检测，可按厂家提供的条件进行操作。浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度，进行对倍稀释预实验。选定最佳的稀释滴度后再进行批量实验。染色背景深大多是抗体浓度过高所致。抗体孵育温度一般以常温25℃为基准或37℃30分钟，也可4℃冰箱过夜。
5．冲洗：常用的冲洗液为PBS或TBS缓冲液，要严格执行冲洗步骤，防止因冲洗不净引起的背景着色，缓冲液中加入Tween20可以增强冲洗效果。
6．检测系统：通用的检测系统有生物素标记的ABC、SP、LSAB等，此类检测系统较为经济，日前仍有不少医院在使用。非生物素类检测系统价钱较贵，由于不需通过生物素的结合，可以避免内源性生物素的干扰，其特点：敏感、省时、方便、背景低。
7．显色系统：由于检测系统采用的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）作为酶的底物，若采用碱性磷酸酶系统则选择BCIP/NBT（蓝紫色）,常规免疫组化显色首选的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低，BCIP/NBT阳性虽鲜艳，但阳性定位不准确。
8．复染：衬染步骤十分简单，但衬染的好坏对染色最终结果的质量影响很大。有的选用Harris苏木素，有的用Mayer’s苏木素，且与DAB染色对照效果最好，在绝大多数实验室中使用简单方便。也有实验室使用甲基绿衬染衬染，但不能经有机溶剂，容易退色。
五、染色结果的观察
1．阳性结果应定位在细胞相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：
（1）细胞膜：如LCA和CD3、CD20等；
（2）细胞质：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；
（3）细胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。
2．组织的周边、气泡、刀痕、皱折等部位往往呈现非特异性阳性表达。
3．染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
4．组织切片背景深与下列因素有关：
（1）石蜡切片脱蜡不干净；
（2）第一抗体浓度过高或孵育时间过长，温度过高；
（3）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多；
（4）抗体不纯；
（5）抗体孵育后切片清洗不干净。
六、免疫组化实验对照
为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
1．阳性对照:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。
2．阴性对照:选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性。每次实验中增加Vimentin染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。Vimentin几乎在任何组织中都有表达，尤其适合活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是不当的固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入Vimentin染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。
七、抗体的保存和稀释
一般来说，抗体应放在4℃冰箱中保存，第一抗体可分成小包装于-20℃保存，使用时存放在4℃，不宜反复存放于4℃和-20℃之间，反复冻融会使抗体效价下跌。检测系统一般不宜于-20℃保存，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。可将抗体稀释至1：10，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。
Nestin、PDGFR 可用于胃肠间质瘤的诊断指标，尤其对CD117阴性胃肠间质瘤在诊断上有很大的帮助，在国外已有文献报导。这两种抗体可用于常规固定的石蜡切片，经实验证明Nestin 用PH8.0 EDTA高压修复，PDGFR用PH6.0 柠檬酸微波修复效果较好。
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