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PCR克隆需要提取表达基因的组织或细胞的RNA,反转录为cDNA,再从cDNA扩增出目的基因。获得的目的基因不大容易做序列上的修改,任何突变体都必须通过后续的突变步骤得到。密码子优化就更不可能了。
PCR克隆的另一个重大局限是对表达丰度低的基因、表达时间极短的基因等特殊基因难以成功克隆。比较而言,全基因合成是一种更加灵活,更容易成功而且价格更便宜的克隆方法。