细胞溶酶体脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量检测试剂...

细胞溶酶体脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量检测试剂盒使用说明

主要用途

细胞溶酶体脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过溶酶体脂酶反应系统中，在选择性抑制剂存在与否的情况下，底物胆固醇油酸酯水解后的游离脂肪酸，与醋酸铜反应后的蓝绿色产物，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解样品（动物、人体、昆虫等）溶酶体脂酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

溶酶体酸性脂酶（lysosomal acid lipase；LAL；EC3.1.1.13），又称为酸性胆固醇酯水解酶（acid cholesteryl ester hydrolase），是脂蛋白代谢中的水解酶（hydrolase）之一，含有372氨基酸的糖蛋白，存在于除红细胞外的所有组织细胞中的溶酶体内。在酸性环境下，通过水解胆固醇酯（cholesterol ester）和甘油三酯（triacylglycerols）键，以降解细胞内的脂蛋白，释放出游离脂肪酸，调节细胞内的脂类代谢，尤其是胆固醇合成和甘油三酯代谢。溶酶体脂酶缺陷将导致伍尔曼氏病（Wolman disease）和胆固醇酯储积病Cholesteryl Ester Storage Disease）。溶酶体脂酶具有治疗动脉粥样硬化（atherosclerosis）和外周血管性疾病的潜力。基于底物胆固醇油酸酯（cholesterol oleate），在溶酶体酸性脂酶特异性抑制剂氯丙嗪（chlorpromazine）存在与否的情况下，通过溶酶体酸性脂酶的水解催化，产生游离脂肪酸油酸（oleate），继而与生色试剂醋酸铜反应，产生蓝绿色铜盐复合物，在分光光度仪下，其吸光值的变化（715nm 波长），来定量测定溶酶体酸性脂酶的活性。其反应系统为：

lysosomal acid lipase

cholesterol oleate  +  H2O      →      cholesterol  +  oleate

chlorpromazine（+/—）

产品内容

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）    20毫升

缓冲液（Reagent C）  50毫升

底物液（Reagent D）   5毫升

稀释液（Reagent E）    50毫升

显色液（Reagent F）  10毫升

专性液（Reagent G）     1毫升

标准液（Reagent H）     1毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，稀释液（Reagent E）和标准液（Reagent H）具有挥发性和毒性，注意密闭瓶盖和操作安全；有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

2毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）

• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

• 小心抽去清理液

• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

• 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

• 小心抽去上清液

• 加入1毫升裂解液（Reagent B），充分混匀

• 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群

• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器

• 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）

• 将所有细胞匀浆物移入1.5毫升离心管

• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为800g

• 小心移出上清液到另一个新的预冷的1.5毫升离心管 

• 放进4℃微型离心机离心15分钟，速度为10000g

• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒 

• 加入500微升缓冲液（Reagent C）

• 强力涡旋震荡15秒

• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
  

测定准备

• 准备好待测样品（例如细胞裂解样品等），置于冰槽里

• 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长715nm，使用稀释液（Reagent E）置零 

• 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
  

三、标准样品配制

• 准备好4个1.5毫升离心管，标记为1至4号管

• 分别加入200微升稀释液（Reagent E）到2至4号管

• 移取400微升标准液（Reagent H）到1号管

• 小心移取200微升1号管的标准液（Reagent H）到2号管，混匀

• 小心移取200微升2号管稀释的标准液（Reagent H）到3号管，混匀

• 将1至4号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

标准曲线测定

• 移取900微升稀释液（Reagent E）到2毫升离心管

• 加入100微升上述配制的标准液（Reagent H）

• 加入200微升显色液（Reagent F）

• 涡旋震荡60秒

• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g

• 小心移取1毫升蓝绿色上层液相到新的比色皿

• 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

• 重复实验步骤1至7四次

• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准油酸浓度（毫摩尔/升）

背景对照测定

• 移取800微升缓冲液（Reagent C）到2毫升离心管

• 加入100微升底物液（Reagent D）

• 加入100微升稀释液（Reagent E）

• 涡旋震荡60秒

• 37℃温度下孵育30分钟

• 移取100微升到新的2毫升离心管

• 加入1毫升稀释液（Reagent E）

• 加入200微升显色液（Reagent F）

• 涡旋震荡60秒

• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g

• 小心移取1毫升上层液相到新的比色皿

• 即刻放进分光光度仪检测：获得背景吸光读数
  

六、样品总活性测定

• 移取800微升缓冲液（Reagent C）到2毫升离心管

• 加入100微升底物液（Reagent D）

• 加入100微升上述制备的待测样品（50微克样品蛋白）

• 涡旋震荡60秒

• 37℃温度下孵育30分钟

• 移取100微升到新的2毫升离心管

• 加入1毫升稀释液（Reagent E）

• 加入200微升显色液（Reagent F）

• 涡旋震荡60秒

• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g

• 小心移取1毫升蓝绿色上层液相到新的比色皿

• 即刻放进分光光度仪检测：获得样品吸光读数

• 实际吸光读数：样品吸光读数—背景吸光读数

• 根据标准曲线获得样品对应油酸浓度（毫摩尔/升）

样品非特异活性测定

• 移取750微升缓冲液（Reagent C）到2毫升离心管

• 加入100微升底物液（Reagent D）

• 加入50微升专性液（Reagent G）

• 加入100微升上述制备的待测样品（50微克样品蛋白）

• 涡旋震荡60秒

• 37℃温度下孵育30分钟

• 移取100微升到新的2毫升离心管

• 加入1毫升稀释液（Reagent E）

• 加入200微升显色液（Reagent F）

• 涡旋震荡60秒

• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g

• 小心移取1毫升蓝绿色上层液相到新的比色皿

• 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

• 实际吸光读数：样品吸光读数—背景吸光读数

• 根据标准曲线获得样品对应油酸浓度（毫摩尔/升）

计算样品活性

样品总活性和非特异活性计算

[根据标准曲线获得样品对应油酸浓度（毫摩尔/升）X 10（稀释倍数）X 1（反应体系容量；毫升）]÷[ 0.1（样品容量；毫升）X 30（反应时间；分钟）]＝微摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔/毫克/分钟

样品特异活性计算

样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照

• 操作时，须戴手套

• 系统操作过程中，背景测定只需1次

• 样品须澄清，至关重要

• 如果底物液（Reagent D）粘稠，加热孵育后呈现乳白色液体，即可使用

• 比色测定后，比色皿须清洗彻底

• 样本读数高于背景读数表明具有酶活性

• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）

• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

• 溶酶体酸性脂酶单位活性定义为：在37℃，pH 5.0条件下，每分钟内能够释放1微摩尔游离脂肪酸所需的酶量作为一个活性单位

• 本公司提供系列细胞脂类酶学检测试剂产品