及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
分离方法的选择
根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：
蛋白质的性质 | 方法 |
电荷（等电点） | 离子交换（IEX） |
分子量 | 凝胶过滤（GF） |
疏水性 | 疏水（HIC）反相（RPC） |
特异性结合 | 亲和（AC） |
每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。
分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。
处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。
速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。
回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：
技术 | 主要特点 | 捕获 | 中度纯化 | 精制 | 样品起始状态 | 样品最终状态 |
IEX | 高分辨率 高容量 高速度 | ★★★ | ★★★ | ★★★ | 低离子强度 样品体积不限 | 高离子强度或pH改变。 样品浓缩 |
HIC | 分辨率好 容量好 高速度 | ★★ | ★★★ | ★ | 高离子强度 样品体积不限 | 低离子强度 样品浓缩 |
AC | 高分辨率 高容量 高速度 | ★★★ | ★★★ | ★★ | 结合条件特殊 样品体积不限 | 洗脱条件特殊 样品浓缩 |
GF | 高分辨率 （使用Supedex） | ★ | ★★★ | 样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制 | 缓冲液更换（如果需要） 样品稀释 | |
RPC | 高分辨率 | ★ | ★★★ | 需要有机溶剂 | 在有机溶剂中，有损失生物活性的风险 |
提示：
1、 通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。
2、 硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。
3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。
4、 在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法
5、 如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。
6、 只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。
注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。
附：纯化工艺路线
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