菌株的构建和四分体孢子的分析—二倍体细胞的孢子形成

孢子形成平板或孢子形成培养基适当的营养成分YPD培养基

平板

1）挑YPD或选择性平板上的酵母菌单菌落接种在孢子形成平板上。如果无需选择的话，细胞在转移到孢子形成平板之前，可以在YPD平板上先培养几天。单个菌落在YPD平板上生长3〜4天，而对成小块细胞来说，可在YPD平板上生长2天。这种预生长并 非必需的，但它可以使孢子形成的效率更高些。在转移酵母细胞时，应用少量细胞在孢子形成平 板上涂布相对较大的面积（约1cm2),不应见到成团的接种物。

2）于25℃培养4天。在较髙的温度下孢子形成的效率一般很低。在缺乏氨基酸或其他酵母菌有丝分裂生长所必需的营养成分时，酵母菌就会进行减数分裂形成孢子。某些特殊的酵母菌必须添加特定的营养成分孢子 形成才会更加完全。

3）在载玻片上滴一滴水，挑少量细胞稀释在水中，于放大倍数250×〜400×显微镜下观察悬浮于水中的四分体孢子。

4）四分体呈成簇的4个小球（孢子），被固定于一个致密的子囊中。四个孢子排列为钻石状或正四面体状。

在琼脂平板的表面，交配相反交配型的菌株可以构建成二倍体（patch mating)。 具体做法是：在琼脂平板（此平板应允许两种单倍体亲本的生长）上的一个0.5 cm直径的小圈中，用牙签分别挑新鲜亲本单倍体菌落，混杂在一起，于30℃交配4 h以上，然后将交配混合物划线在选择性平板上以选择二倍体基因型。

如果二倍体基因型无特别的选择标志（当单倍体亲本中的一种具有与二倍体相同的营养需要时），使用解剖显微镜从交配混合物中“拉出合子”，可达到分离二倍体的目的。交配4 h以后，在适合二倍体生长的平板上将交配混合物画几条平行线，使用解剖显微镜通过其典型的形态确认合子细胞，用分离针将它们挑出、与其他细胞分开，为了保证选择的细胞确实是二倍体，将它们接种在孢子形成平板上,经过适当条件培养后，在显微镜下检查四分体孢子的形成。也可采用另一种方法确认：用一对交配型实验菌株与选择出的细胞进行交配，在显微镜下检査每个实验株的合子形成情况，如果二倍体挑选正确，那么就不可能形成合子。