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脯氨酰异构酶活性首先是使用基于糜蛋白酶的测定法发现的。仅当脯氨酸肽键处于反式状态时,蛋白水解酶糜蛋白酶对四残基肽Ala-Ala-Pro-Phe具有非常高的底物特异性。将胰凝乳蛋白酶添加到含有具有该序列的报告肽的溶液中会导致约90%的肽快速裂解,而那些具有顺式脯氨酸键的肽-在水溶液中约为10%-以受未催化的脯氨酸异构化限制的速率裂解。如果它具有真正的脯氨酰异构酶活性,则添加潜在的脯氨酰异构酶将加速后一反应阶段。