异硫氰酸胍/氯化铯超速离心法制备 RNA 实验

实验材料 细胞和组织

试剂、试剂盒 氯仿氯化铯溶液二硫苏糖醇EDTA乙醇异硫氰酸胍裂解缓冲液异丙醇N-月桂酰肌氨酸氯化锂液氮β-巯基乙醇苯酚

仪器、耗材 离心机和转子研钵和杵超速离心管

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

氯仿

氯化铯溶液，5.7mol/L(5.7mol/L 氯化铯，25 mmol/L 醋酸钠，pH6.0，1mmol/LEDTA,pH8.0)

用焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的水

二硫苏糖醇（DTT)，0.2 mmol/L

EDTA,1mmol/L，pH8.0

乙醇，70%(体积分数）

异硫氰酸胍裂解缓冲液 (4mol/L 异硫氰酸胍，25 mmol/L 醋酸钠，pH6.0,1mmol/LEDTA,pH8.0)

异丙醇

N-月桂酰肌氨酸，20%（200 g/L)

氯化锂（LiCl),8mol/L

液氮

β-巯基乙醇,10 ml/L

苯酚, 水饱和，pH4.0

2. 离心机和转子

BeckmanTi50 转子或相当的转子

3. 特殊设备

研钵和杵，用 DEPC 处理过的水洗涤，预冷

超速离心管（异质同晶共聚材料），或相当的 Polygon, 或相当的高速匀浆器

4. 细胞和组织

细胞/组织，冻于液氮

二、方法

1. 使用研钵和杵在液氮下将样品研磨成细粉。使用 Polygon 均化器或其他合适的器具在 7 ml 胍裂解缓冲液中均质化组织或细胞（达 1X109 个）。

2. 将 4 ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液加到超速离心管中。

3. 将 1ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液、120ul10mol/L 的沒-巯基乙醇和 240ulN-月桂酰肌氨酸加到裂解产物中。

4. 将氯化铯/裂解产物混合物混合，小心使之位于离心管中的氯化铯溶液上分层。

5.20°C 下 180000 g 离心 21 h。

6. 移弃氯化铯上清液，小心避免扰动管底的 RNA 沉降物。

7. 小心将 RNA 沉降物再溶解于 750ul 异硫氰酸胍裂解缓冲液中。

8. 加等体积酚，混匀。

9.10000g 离心 15 min。

10. 将水相转移到一新管中。重复水相的酚抽提，直到界面变清。

11. 向清澈的水相加 1 倍体积氯仿。

12. 混合，l0000 g 离心 l0 min。

13. 将水相转移到一干净试管中。加等体积的异丙酵和 1/10 体积 8mol/L 的氯化锂。10000g 离心10min。

14. 移弃上清液。用 750ul70% 乙醇洗涤 RNA 沉降物，10000 g 离心。

15. 移弃乙酵，风干沉降物，再溶解于 50~500ul0.2 mmol/L 的 DTT 中。

16.RNA 储存于-70°C。