[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
总mRNA的提取(自己的经验)
一、关于Trizol Reagent需要的试剂
1． Chloroform：氯仿 (分析纯)
2． Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4． RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50μl），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃ 3小时）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、关于Trizol Reagent的使用过程：
1． Homogenization（匀浆）
a.Tissues：组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
b.Cells Grown in monolayer（单层细胞接毒后出现病变的）
针对JEV细胞总RNA的抽提法：
BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）约5ml，维持天。出
现75%-100%的病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两
种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶
底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染）具体方法如下：（样品一定要新鲜）
（1）组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。
（2）加氯仿0.2ml（每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。
（3）4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。
（4）仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。
（5）加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。
（6）4℃离心，10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
（7）弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml
Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无
Rnase dH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保存备用。
（8）抽提出的细胞总RNA干燥后加水50μl，取10μl加无Rnase水990μl，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio<1.6。
（9）分离组织10mg（纯组织）加800μl Trizol试剂。
（10）扩增产物的鉴定
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