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胡金胜 熊亮 朱桃玉 崔宇
引言
临近春分，春意渐浓，正是踏青郊游的好时节。当我们漫步在田野上，溯流在小河边，经常会发现成片匍匐的“草莓苗”，但仔细观察叶裂和叶齿还是有很大差异。年轻人误以为是野生草莓苗将它们移栽到阳台，而上年纪的长辈则会掐一些嫩苗带回家煲汤。等到了清明节，这片幼苗在雨水的滋润下长得茎壮叶茂，酷似艾草，但茎四棱和对生叶给出了否定答案。如果把它当作艾草榨成汁拌进糯米粉里蒸熟，这样就得到了具有独特苦味的青团。至此，想必大家已经猜到了这片植株便是益母草。幼苗期的基生叶容易与草莓幼苗混淆，花期前唇形科特有的茎四棱又很容易与艾草区分开来。夏至前后，益母草主茎中上部的各个叶腋处会开出红白色、粉色或紫红色的唇形小花，排成轮伞花序，图 1 便是正值花期的益母草，非常容易辨识。
图1正值花期的益母草
益母草为唇形科益母草属一年或二年生草本植物，广泛分布于全国各地。据《本草纲目》记载，益母草之根、茎、花、叶、实，并皆入药，可同用。益母草含有生物碱类、二萜类、黄酮类及挥发油等多种成分，具有活血调经，利尿消肿，清热解毒之功效，可用于月经不调，痛经经闭，恶露不尽，水肿尿少，疮疡肿毒等病症。《中国药典》规定了益母草的炮制方法：鲜品春季幼苗期至初夏花前期采割；干品夏季茎叶茂盛、花未开或初开时釆割，晒干，或切段晒干。图 2 所示的是炮制后的益母草干品。
图2益母草经炮制后入药
01
分析困局
现代医学研究表明，益母草的药理作用和它所含生物碱密切相关，而益母草所含的生物碱主要为水苏碱和益母草碱。在《中国药典 2020 版》-一部-药材和饮片 中，收录了益母草相关品种十余个，含量测定项下的目标组分为盐酸水苏碱和盐酸益母草碱（分子结构式如图 3 所示）。水苏碱分子结构含吡咯环和羧基，极性较强，反相保留较弱，并且紫外吸收较弱；益母草碱分子结构含有苯环和胍基，具有一定反相保留能力，但峰形容易拖尾，紫外吸收较强。表 1汇总了《中国药典 2020 版》中收录益母草相关品种【含量测定】检测方法，其中以亲水作用(HILIC)或强阳离子交换(SCX)色谱柱配合紫外检测器(UV)或蒸发光散射检测器(ELSD)为主。
左：盐酸水苏碱 4136-37-2
右：盐酸益母草碱 24735-18-0
图 3 盐酸水苏碱和盐酸益母草碱分子结构式
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表 1 《中国药典 2020 版》中收录益母草
相关品种【含量测定】检测方法汇总
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由于益母草本身成分复杂，经过不同的炮制工艺以及与其它药材配伍后得到的中成药或复方制剂，让提取的供试品溶液在液相分析时存在着较多的基质干扰，而现有的分析方法单纯依赖亲水作用或离子交换的分离机理，通常不能有效分离目标峰附近的干扰峰，无法实现准确的定性和定量，这一难题也长期困扰着众多中药分析工作者。
02
行业动态
近期，山东中医药大学的劳永真老师与中国中医科学院中药研究所的苏江敏老师等，联合在《环境化学》上发表了一篇题为《高效液相色谱-电雾式检测法测定复方益母草胶囊中盐酸水苏碱》的论文，文中“采用高效液相色谱-电雾式检测器法（HPLC-CAD），建立定量测定复方益母草胶囊中盐酸水苏碱的新分析方法，快速有效的评价复方益母草胶囊的质量”，并且“对比ELSD 和CAD 不同检测器的检测限（LOD）和定量限（LOQ），考察市场不同型号色谱柱对复方益母草胶囊中盐酸水苏碱的分离效果，以及提取溶剂对盐酸水苏碱提取效率的影响”。
结果表明：“通过对比10 种亲水作用色谱柱 (HILIC)，最终确定利用Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱键合相的叔胺官能团，在 HILIC 模式下对盐酸水苏碱的强保留能力，可有效与供试品杂质峰分离，避免基质干扰。采用乙腈-20 mmol·L-1 甲酸铵 (pH=4.0) = 90:10 作为初始流动相进行梯度洗脱，配合CAD 检测器测定盐酸水苏碱含量，结果显示CAD 具有较高的灵敏度，为定量分析盐酸水苏碱提供了新方法新参考。”
图 4 为文中展示的Acclaim Mixed-Mode WAX-1配合CAD检测器测定复方益母草胶囊中盐酸水苏碱含量的相关谱图。
图 4 盐酸水苏碱对照品、供试品、阴性对照HPLC-CAD色谱图（点击查看大图）
03
赛默飞在行动
与此同时，赛默飞实验室针对分析工作者及消费者关注度比较高的两个品种——益母草颗粒和益母草膏开展了相关试验。
1
Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于益母草颗粒和益母草膏中盐酸水苏碱含量测定
Acclaim Mixed-Mode WAX-1, 5 μm,
4.6×250 mm (P/N: 064985)
图 5 盐酸水苏碱对照品溶液谱图 (100 μg/mL)
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图 6 益母草颗粒对照品、供试品溶液叠加谱图
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图 7 益母草膏对照品、供试品溶液叠加谱图
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2
Acclaim Mixed-Mode WCX-1 应用于益母草颗粒和益母草膏中盐酸益母草碱含量测定
Acclaim Mixed-Mode WCX-1, 3 μm,
3.0×150 mm (P/N: 070092)
图 8 盐酸益母草碱对照品溶液谱图 (10.0 μg/mL)
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图 9 益母草颗粒对照品、供试品溶液叠加谱图
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图 10 益母草膏对照品、供试品溶液叠加谱图
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试验结果表明：采用Acclaim Mixed-Mode WAX-1 配合CAD检测器应用于益母草颗粒和益母草膏中盐酸水苏碱含量测定，对照品和供试品溶液中盐酸水苏碱主峰附近均无干扰峰，不对称因子均接近1.0，理论塔板数均大于12,000；采用Acclaim Mixed-Mode WCX-1 配合DAD检测器应用于益母草颗粒和益母草膏中盐酸益母草碱含量测定，对照品和供试品溶液中盐酸益母草碱主峰附近均无干扰峰，不对称因子均接近1.0，理论塔板数均大于12,000。本试验中，盐酸水苏碱和盐酸益母草碱的理论塔板数是药典规定值的两倍多。
Tips：
由于益母草中盐酸水苏碱与盐酸益母草碱含量相差10倍多，盐酸水苏碱紫外吸收较弱，盐酸益母草碱紫外吸收强，盐酸益母草碱含量低，在CAD上响应低且峰形容易受到干扰，因此需要两个检测器进行分析。本试验中两个方法采用了相同的流动相，后续实验室提高检测效率可采用Vanquish Duo双三元液相系统配合CAD和DAD检测器同时分析两个目标组分。
关于Acclaim Mixed-Mode混合模式色谱柱
Acclaim Mixed-Mode 系列混合模式色谱柱能够在单一键合相上提供多种保留机制，选择性与 C18 反相色谱柱互补。Acclaim Mixed-Mode WAX-1键合相为带有叔胺末端的疏水烷基链键合硅胶，疏水烃链提供反相保留 (RP)，叔胺端基提供弱阴离子交换 (WAX)，适用于酸性化合物分析，如含羧酸、磺酸官能团结构，有机酸类。Acclaim Mixed-Mode WCX-1键合相为带有羧基末端的疏水烷基链键合硅胶，疏水烃链提供反相保留 (RP)，羧基端基提供弱阳离子交换 (WCX)，适用于碱性化合物分析，如含伯/仲/叔胺及季铵结构，有机胺类、含氮杂环结构。
图 11 Acclaim Mixed-Mode 系列双重混合模式色谱柱键合相示意图（点击查看大图）
关于电雾式检测器 (CAD)
电雾式检测器（Charged Aerosol Detector; CAD）是赛默飞独有的一款新型的质量型通用检测器，它灵敏度高，重复性好，对非挥发和半挥发的化合物均有良好响应，为无紫外吸收和弱紫外吸收化合物的液相分析提供了新的利器。目前已有去氧胆酸和钆布醇等多个品种的CAD方法被美国药典和欧洲药典收录。在2020版中国药典0512通则中，CAD检测器也已被收录。在中药配方颗粒国家标准中，青葙子、麦冬等品种采用了CAD检测器进行特征图谱或含量的测定。
图 12 电雾式检测器（CAD）（左：Vanquish CAD系列；右：Corona Veo系列）
参考文献：
[1] 劳永真,苏江敏,章军等.高效液相色谱-电雾式检测法测定复方益母草胶囊中盐酸水苏碱[J].环境化学,2023,42(02):675-678.
[2] Acclaim Mixed-Mode 系列色谱柱应用于益母草颗粒、益母草膏中盐酸水苏碱和盐酸益母草碱含量的测定
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